טכנולוגיית ACE מאפשרת הגברת אותות מרובים ורגישים ביותר כדי לזהות חלבונים בתאים בודדים באמצעות ציטומטריית מסת השעיה של תאי יחיד וניתוח ציטומטריית מסה הדמיה. איור זה מראה כיצד ניתן לכמת חלבונים בתאים בודדים של קטע רקמה עם נוגדנים משופרים ACE הנקשרים אליהם. קרדיט: Su Min Suh/SciStories
ACE, פורץ דרך DNAטכנולוגיית הגברת אותות מונעת, משפרת משמעותית את הרגישות של ציטומטריית המונים, ומספקת תובנות חדשות לגבי תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים שונים.
מאז שנות ה-50, חוקרים השתמשו ב"זרימה ציטומטריית", טכניקה ידועה שהגה וואלאס קולטר, כדי לאפיין סוגים שונים של תאי חיסון במחקרים ודגימות דם אנושיות. שיטה זו שיפרה משמעותית את ההבנה שלנו בפיתוח תאי חיסון וסיפקה גישות חדשניות להערכת בריאות האדם ואבחון סוגי סרטן דם שונים. בסופו של דבר, ציטומטריית הזרימה הורחבה כדי לנתח גם סוגי תאים אחרים.
בציטומטריית זרימה מסורתית, חלבונים משטח התא וחלבונים תוך-תאיים מתגלים באמצעות מולקולות נוגדנים המקושרות לבדיקות פלואורסצנטיות. עם זאת, תוך מתן רגישות לתא בודד, שיטה זו מוגבלת באיתור חלבונים מרובים על ידי מספר הפלואורופורים שניתן להבחין בבירור בכל הספקטרום של אור פלורסנט.
הופעתה של "ציטומטריית המונים" בשנת 2009 אפשרה כימות בו-זמנית של 50 חלבונים בתאים בודדים, וניתוח דק יותר של זהויות התאים והמצבים הפיזיולוגיים. בציטומטריה המונית, נוגדנים מקושרים לאיזוטופים לא רדיואקטיביים של יסודות מתכת. ניתן לכמת איזוטופים אלה בערוצים שונים של מכשיר ציטומטר מסה על סמך המסה שלהם. עם זאת, ציטומטריית מסה, ובת דודתה "ציטומטריית מסה תמונה" (IMC), המשמשת להמחשת חלבוני תאים בפרוסות רקמה שלמות, באה במחיר של רגישות מופחתת בהשוואה ל-flow cytometry ומיקרוסקופ פלואורסצנטי.
כעת, עוד 15 שנים מאוחר יותר, שיתוף פעולה מחקרי בראשות מכון ויס באוניברסיטת הרווארד וכולל גם חוקרים מ MIT ואוניברסיטת טורונטו פיתחה שיטה לשיפור משמעותי של הרגישות של ציטומטריית המונים ו-IMC באמצעות ננוטכנולוגיה של DNA. יישום טכנולוגיית הגברת אותות חדשה בשם "הגברה באמצעות הרחבה מחזורית" (ACE) על ברקודים של DNA המקושרים לנוגדנים, הם הצליחו להגביר את אותות החלבון המיוצרים על ידי איזוטופי מתכת הקשורים לנוגדנים יותר מפי 500, ובו זמנית וברגישות גבוהה לזהות יותר מ-30 חלבונים שונים.
השיטה החדשה אפשרה להם לזהות כמותית חלבונים נדירים, לחקור שינויים מורכבים ברקמות ביולוגיות, ולחקור כיצד רשתות שלמות של חלבונים מחוברים זה לזה, המווסתים את תפקוד תאי החיסון מגיבות לגירוי ולמצבים פתולוגיים. מיושם על IMC, ACE אפשרה גם זיהוי של סוגי תאים ומחלקי רקמות בחתכים היסטולוגיים, ושינויים בארגון הרקמה הקשורים לפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטית. הממצאים מדווחים ב טבע ביוטכנולוגיה.
"ACE עוזר לסגור פער מכריע בניתוח ציטומטרי: על ידי שיפור הרגישות של ציטומטריית המונים, הוא מאפשר פלטפורמת ניתוח תא בודד המשיגה בו זמנית רגישות גבוהה, ריבוי רב ותפוקה גבוהה. ההזדמנויות שהיא פותחת לחקירת תאים בודדים ברקמות תלויות וברקמות שלמות עם גישות מרובות ורגישות ביותר יכולות לספק הבנה עמוקה הרבה יותר של תהליכים ביולוגיים נורמליים ופתולוגיים", אמר חבר סגל הליבה של מכון ויס, פנג יין, Ph.D., שהוביל את לימוד. ין הוא גם פרופסור במחלקה לביולוגיה מערכות (HMS).
יותר DNA, יותר איזוטופי מתכת, יותר רגישות
בעבר, יין וקבוצתו במכון ויס פיתחו מספר טכנולוגיות הדמיה המופעלות על ידי DNA שיכולות לחשוף את פעולתם הפנימית של תאים ברזולוציה גבוהה במיוחד ברמת מולקולה בודדת, או על ידי הדמיה של תאים שונים. RNA ומולקולות חלבון בפרוסת רקמה אחת. אבל מבני ה-DNA שנוצרים בשיטות אלו אינם עמידים מספיק כדי לעמוד בתנאים הקשים יחסית המשמשים בציטומטריה המונית.
"ACE פותר את בעיות הרגישות הנוכחיות של ציטומטריית מסה בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לשייך מולקולות נוגדנים למספר מוגבר משמעותית של איזוטופי מתכת בהשוואה לציטומטריה מסה קונבנציונלית. זה מקל באופן משמעותי על הכימות של מגוון רחב של חלבונים בשפע נמוך, שהיה מאתגר באמצעות גישות קודמות של תא בודד", אמר הסופר הראשון שיאו-קאנג לון, Ph.D., שהוא פוסט-דוקטורט בקבוצתו של יין . לון שיתף פעולה בפרויקט עם המחבר הראשון Kuanwei Sheng, Ph.D., אשר פיתח בתחילה ACE עבור יישומים אחרים, כולל הדמיה מרובה, והוא גם עמית פוסט-דוקטורט שעובד עם Yin. "בהשראת העבודה הקודמת שלנו על תגובת ה-Primer Extension ליצירת קונקטמרים ליניאריים של DNA (עותקים מרובים של אותו רצף DNA מקושרים בסדרה), ותגובת PCR המשיגה הגברה באמצעות מחזורים תרמיים מסונכרנים, המצאנו את ACE כדי לסנתז קונקטמרים ליניאריים. באתרו באמצעות רכיבה תרמית בצורה ניתנת לשליטה", אמר שנג.
ACE יוצר פיגום עם מספר אתרי קשירה עבור "גדילי גלאים" קצרים הנושאים איזוטופים מתכתיים. בנוסף, על ידי הסתעפות הסינתזה של גדיל הפיגום, יוכלו החוקרים להגביר עוד יותר את רגישות השיטה לזיהוי חלבונים נדירים. ACE ליניארי מספק בממוצע הגברת אות פי 13 בעוד שהסתעפות ACE מאפשרת להגדיל אות לא מוגבר תחילה יותר מפי 500. כדי לייצב את כל קומפלקס רצף ה-ACE ולשמור אותו שלם במהלך ניתוח ציטומטריית המונים, הם צלבלו את הגדילים הכפולים הקצרים שנוצרו בין הפיגום לגדילי הגלאי שנוספו בעזרת צולב כימי. "בעקבות המתכון הזה, עיצבנו פאנל עם 33 רצפי ACE מובחנים (אורתולוגיים) שהסינתזה שלהם לא מפריעה זה לזה, ויישמנו אותו על שלושה סוגים שונים לגמרי של ניתוח", אמר שנג, שהוא גם פוסט דוקטורט ב-Yin's קְבוּצָה.
ACE בעבודה
הצוות השתמש לראשונה ב-ACE כדי לחקור את המעבר של תאי אפיתל לתאי מזנכימליים ובחזרה לתאי אפיתל. מעברים אפיתל-מזנכימליים (EMTs) ומעברים mesenchymal-apithelial (METs) מתרחשים במהלך התפתחות עוברית, אך הראשון בפרט נרקם מחדש גם כאשר הגידולים הופכים פולשניים וגרורתיים. על ידי יצירת פרופיל בסך 32 סמני אפיתל ומזנכימליים, מולקולות איתות וגורמי שעתוק נדירים בתאי סרטן שד של עכבר בודד פעמים רבות במהלך המעבר שלהם ממצב אפיתל למצב מזנכימלי ובחזרה, וניתוח חישובי של התוצאות, הם הצליחו לשפוך אור חדש על שני התהליכים. "ACE איפשר לנו ליצור פרופיל של רמות של גורמי שעתוק בשפע נמוך בו-זמנית עם סמנים המשקפים מצבים פיזיולוגיים ותאי איתות בתאים בודדים. זה הוביל לתמונה מעודנת יותר של האופן שבו תוכניות מולקולריות ב-EMT וב-MET מונעות על ידי הגדלת והקטנת כמויות של גורמי שעתוק מרכזיים, כולל Zeb-1 ו-Snail/Slug", אמר שנג.
בדוגמה השנייה שלהם, הם התקרבו לפעולה הפנימית של תאי T בודדים. הגירוי של מולקולות קולטן תאי T (TCR) על פני השטח שלהן מביא להפעלה של רשת מורכבת של חלבוני איתות תוך תאיים. ניתוח תגובות האיתות הללו ברזולוציה של תא בודד היה קשה, גם בשל גודלם הקטן של תאי T. חלבונים בודדים של רשת זו מופעלים על ידי שאריות פוספט המחוברות אליהם על ידי חלבוני רשת אחרים הידועים בדרך כלל בשם קינאזות. רבים מחלבוני הרשת המופעלים הללו ממשיכים לזרחן חלבונים אחרים של הרשת. זה מוביל בסופו של דבר לשינויים בהתנהגות תאי T, למשל, כלפי פתוגנים או תאים סרטניים. החוקרים יישמו ACE על פאנל של 30 נוגדנים שנקשרו ספציפית למוטיבים מפוספסים בחלבוני רשת TCR עם פונקציות במתח, דלקת, התפשטות תאים ותגובות אחרות. "באמצעות ניתוח ציטומטריית מסה משופרת ACE, תפסנו צילומי מצב כמותיים של רשת ה-TCR המשתנה באופן דינמי בתאי T אנושיים ראשוניים בודדים. זה איפשר לנו לחקור את הווריאציות של תא בודד בתזמון ובמשך אירועי הפעלה ספציפיים של תאי T ולגלות כיצד הרשת מופעלת ממצב הקרקע שלה על ידי רמזים חוץ-תאיים", אמר לון.
הצוות השתמש באותו פאנל נוגדנים משופר ACE כדי לחקור תופעה המכונה "שיתוק תאי T שנגרם על ידי פציעה". תאי T החווים פגיעה בסביבתם, כגון פציעות רקמות הנגרמות בהליכים כירורגיים גדולים, הופכים לעתים קרובות לדיכוי חיסון. כדי להתחיל להבין כיצד רשת ה-TCR גורמת לכך, הקבוצה של יין שיתפה פעולה עם המחבר מיכאל יפה, MD, Ph.D., שהוא פרופסור דוד ה. קוך למדע ופרופסור לביולוגיה וביולוגית ב-MIT ויש לו עניין רב כיצד המיקרו-סביבה המקיפה אתרים של פגיעה ברקמות מדכאת את המערכת החיסונית. יפה סיפקה לצוות דגימות של "נוזל ניקוז לאחר ניתוח" (POF) שהתקבלו ממטופלים שעברו ניתוח. גירוי תאי T עם POFs כמו גם TCRs שלהם אפשרו לחוקרים לבודד שינויים רשת מובהקים שגורמים לתאי T בודדים להפסיק להתחלק ולהיות מותשים.
לבסוף, הם חקרו את התועלת של ACE גם לניתוח מרחבי של חלבונים בחתכי רקמה באמצעות IMC על ידי התמקדות בכליה האנושית. קשה לנתח רקמת כליה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בגלל האוטופלואורסצנטי החזק שלה, ועל ידי IMC מסורתי בגלל שאין לה רגישות. החוקרים פיתחו פאנל של 20 נוגדנים משופרים ACE עבור סמני כליה שונים והשתמשו בו כדי לבחון קטעים של קליפת הכליה שמקורם בחולה עם מחלת כליות פוליציסטית. גישה זו, שבה הם שיתפו פעולה עם מחבר שותף הארטלנד ג'קסון, Ph.D., פרופסור באוניברסיטת טורונטו, קנדה ומומחה בהדמיה מרובבת, אפשרה להם לזהות את סוגי התאים השונים ואת הארגון שלהם בתוך הפרוקסימלי והדיסטלי של הכליה צינוריות, צינורות איסוף וגלומרולים מסננים דם. "גילינו מאפיינים חדשים ספציפיים למחלה של ארגון תאים ורקמות וגילינו שסמן תאי הגזע נסטין, הקשור גם להפרעות בכליות, בא לידי ביטוי בצורה הטרוגנית מאוד על פני גלומרולי", אמר לון. "זה יכול להיות שחלקים שונים של הרקמה יכולים לעבור בו זמנית שלבים פתולוגיים שונים."
"גישת ציטומטריית מסה חדשה זו שפותחה על ידי הצוות של Peng Yin ומשתפי הפעולה שלהם מראה שוב את הכוח של מינוף ננו-טכנולוגיית DNA כדי להטעין טורבו של טכניקה קיימת שרלוונטית מאוד לטיפול קליני, ולהביא אותה לרמה גבוהה בהרבה של רגישות וסגוליות. השיטה הפשוטה יחסית הזו תוביל לתובנות חדשות לגמרי לגבי תפקוד תאים, רקמות ואיברים, הן במהלך בריאות והן במהלך מחלה", אמר מחבר בכיר ומנהל מייסד וויס דונלד אינגבר, MD, Ph.D., שקבוצתו סיפקה מומחיות קריטית. על גירוי תאי T. הוא גם ה יהודה פולקמן פרופסור לביולוגיה של כלי דם בבית החולים HMS ובבוסטון לילדים, וה Hansjörg Wyss פרופסור להנדסה בהשראה ביולוגית בבית הספר להנדסה ולמדעים שימושיים בהרווארד ג'ון א. פולסון.
מחברים נוספים על המחקר הם Xueyang Yu, Ching Yeung Lam, Gokul Gowri, Matthew Serrata, Yunhao Zhai, Hanquan Su, Jingyi Luan, ו-Youngeun Kim. המחקר נתמך על ידי מענקים מ- המכונים הלאומיים לבריאות (פרס מס' ES028374, CA226898, UG3HL145600, UH3CA255133, DP1GM133052, R01GM124401, RF1MH124606 ו-RF1MH128861), ומכון אונטריו לחקר הסרטן.
